دانلود رایگان


بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با - دانلود رایگان



دانلود رایگان

دانلود رایگان
بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR
چکیده گیاه بارهنگ با نام علمی(Plantagomajor.L) جزء خانواده Plantaginaceae می­باشد.از موسیلاژ این گیاه در فرآورده­های دارویی و آرایشی استفاده می­گردد. به منظور بررسی تنوع حاصل از کشت بافت در کالوس­های حاصل از گیاه بارهنگ، 18 تیمار حاصل از کالوس­های القا شده از ریزنمونه­های مختلف در غلظت­های متفاوت هورمونی به همراه یک نمونه شاهد انتخاب و DNA ژنومی با استفاده از روش CTAB استخراج و تنوع موجود بین نمونه­ها با استفاده 6 پرایمر از نشانگر­های ISSRبررسی شد. بررسی تنوع سوماکلونال حاصل در شرایط مختلف کشت، ریزنمونه­ها و واکشت­ها با استفاده از نشانگر­های ISSRنشان دهنده الگوی نواری متفاوت در بین کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های مختلف در محیط­ها و واکشت­های متفاوت بود متوسط تعداد باندهای چند شکل با در نظر گرفتن تمام 59 باند پلی­مورف برابر 83/9 باند به ازای هر آغازگر بدست آمد. تجزیه کلاستر به روش UPGMA و ضریب تشابه دایس با استفاده از نرم افزار DARwinانجام شد. دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر انجام شده، ژنوتیپ­های مورد بررسی را در 6 گروه طبقه­بندی نمود. همچنین مقادیر تشابه ژنتیکی برآورد شده بین افراد بر اساس 59 باند پلی­مورف بین مقادیر 27/0 تا 83/0 با متوسط 54/0 بدست آمد.
کلمات کلیدی: بارهنگ، کالوس، تنوع سوماکلونال، ISSR .
فصل اول مقدمه وکلیات

1-1- مقدمه
قدمتشناختخواصدارویی گیاهان،شاید بیرون ازحافظه تاریخ باشد.یکیازدلایل مهم­ این قدمت،حضورباورهای ریشه­دارمردم سرزمینهای مختلف در خصوص استفاده از گیاهان دارویی است.اطلاعات مربوط به اثرهاوخواص دارویی گیاهان، از زمانهای بسیار دور به تدریج سینه به سینه منتقل گشته و با آداب و سنن قومی درآمیخته و سرانجام در اختیار نسلهای معاصر قرار گرفته است. طبق برخی سنگ نوشته ها و شواهد دیگر، به نظر می­رسد مصریان و چینیان در زمره نخستین اقوام بشری بوده­اند که بیش از 27 قرن قبل از میلاد مسیح، از گیاهان به عنوان دارو استفاده کرده و حتی برخی از گیاهان را برای مصرف بیشتر در درمان دردها کشت کرده­اند(امیدبیگی، 1386).
گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشته­اند. سازمان بهداشت جهانی تخمین­زده است که بیش از 80% از مردم به صورت سنتی و یا مدرن از گیاهان دارویی استفاده می­کنند. بعلاوه برخی از داروهای شیمیایی نیز با الگوبرداری از مواد گیاهی ساخته شده­اند (تریپاتی، 2003). اگرچه تقاضا برای این ترکیبات افزایش یافته است اما برخی از این گیاهان، زیستگاه­های طبیعی محدود دارند و بسته به شرایط محیطی و جغرافیایی محل رویش گیاه، جمع­آوری آنها با مشکلاتی مواجه است. غلظت پایین این ترکیبات در گیاه محدودیت منابع طبیعی، تخریب روزافزون جنگل­ها و مراتع و فضای سبز، نابودی گونه­های متنوع گیاهی و جانوری، مشکلات مرتب با اهلی نمودن و کشت زراعی این گیاهان، توجه محققین را به استفادهاز راهکارهای فناوری زیستی جهت افزایش تولید و بهره­وری گیاهان دارویی معطوف نموده است. فناوری زیستی با بهره­گیری از علوم مختلف مانند بیولوژی، بیوشیمی، ژنتیک و ... با استفاده از راهکارهای کشت سلول­ها،اندام­ها و بافت­ها، مهندسی ژنتیک و نشانگرهای مولکولی قادر است کارایی گیاهان را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد(کومار، 2008).
کشت سلول، بافت­هاواندام­های گیاهیامکان تکثیر انبوهو سریع گیاهان و تولید متابولیت­های ثانویه را در شرایط درون شیشه­ای(Invitro) فراهم می­سازد. با استفادهازاین سیستم کشت، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل شده و مستقلاز محیط، افزایش تولید ترکیباتجدیدنیزامکان­پذیر می گردد(بورگاد، 2002).
تاکنون کشت سلولی طیف وسیعی از گیاهان دارویی بررسی شده است و ترکیبات مهمی نظیر: فلاونوئیدها، تانن­ها، الکالوئیدها و ترپنوئیدها از این طریق تولید شده­اند(امیدی، 1388).

1-1-2- گیاهان دارویی گیاهان دارویی به گسترده وسیعی از گیاهان اطلاق می­شوند که در درمان بیماری و یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می­گیرند. حدود این گستره با فرهنگ ملیاستفاده از گیاهان دارویی، قوانین و مقررات و پیشرفت­های علمی هر کشور تعیین می­شود. در طب سنتی کشورها معمولاً هر گیاهی را می­توان دارویی محسوب کرد. در تعریف دیگر چنین آمده است: گیاه دارویی به گیاهی گفته می­شود که دارای مواد مؤثره مشخصی است، در درمان بیماری به کار می­رود و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه­های معتبر بین­المللی ذکر شده باشد(دوازده­امامی، 1382).

1-1-3- گیاهانی که به عنوان گیاه دارویی شناخته می شوند 1- در پیکر این گیاه مواد خاصی ساخته می­شود به نام مواد مؤثره که این مواد تأثیر فیزیولوژیکی بر پیکر موجود زنده بر جا می­گذارند. این گیاهان برای مداوای برخی از بیماریها مورد استفاده قرار می­گیرند. مواد فعال مذکور در طی یک سلسله فرآیندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی، به مقدار بسیار کم، معمولاً کمتر از وزن خشک گیاه ساخته می­شوند و به متابولیت­های ثانوی نیز معروفند.
2- کاشت، داشت و برداشت گیاهان دارویی، صرفاً به خاطر استفاده از مواد مؤثره آنها صورت می­گیرد.
3- ممکن است اندام خاصی چون ریشه، ساقه، برگها، گل و ... حاوی مواد مؤثره مورد نظر باشد. از این رو نمی­توان تمام اندامهای گیاه مربوط را منبع ماده دارویی مورد نظر دانست.
4- معمولاً از اندامهای مورد نظر به صورت تازه استفاده نمی­شود (و بهتر است نشود). یعنی اندامهای مورد نظر باید تحت تأثیر عملیات خاصی چون: تمیز شدن، هوا خوردن، خشک شدن، پالودگی و ... قرار گیرند و پس از آن مورد استفاده واقع شوند.
5- گیاهان دارویی حاوی مواد مؤثره در مقایسه با عموم گیاهان مورد استفاده در کشاورزی چون غلات و سبزیها که بطور عام و روزمره مورد استفاده انسانند در موارد خاص قابل استفاده­اند"برای تولید آنها سطوح زراعی نسبتاً محدودی نیز کفایت می­کند"(امیدبیگی، 1386).
1-1-4- دلایل رویکرد به گیاهان دارویی استفاده روزافزون مردم از گیاهان دارویی و همچنین تمایل شرکتهای تولید کننده مواد دارویی به داروهای دارای منشاء گیاهی را می­توان به دلایل زیر دانست:
1- تهیه برخی از مواد مؤثره فعال که در صنایع دارویی اهمیت بسیاری دارند، به طور مصنوعی امکان پذیر­نیست و تنها به صورت طبیعی از گیاهان مورد نظر قابل استخراج­اند. این دسته از مواد یا بطور کلی ساختمان شیمیایی ناشناخته­ای دارند و یا به دلیل داشتن ساختمان شیمیایی بسیار پیچیده تهیه آنها بصورت مصنوعی در صنایع داروسازی مشکل و مستلزم هزینه بسیار­گران است.
2- برخی از مواد طبیعی گیاهی، چون سولانین­ها بصورت مستقیم قابل استفاده نیستند. یعنی در صورت استفاده مستقیم فاقد ارزش دارویی­اند. ولی اگر این مواد در صنایع دارویی تحت تأثیر برخی فرآیندهای شیمیایی قرار گیرند و در واقع بصورتی نیمه­طبیعی غیر­مصنوعی درآیند، به موادی فعال و قابل استفاده تبدیل خواهند شد. مواد مؤثره گیاهان پس از تأثیر فرایندهای شیمیایی، بو، طعم و مزه مطلوبتری نیز خواهند داشت.
3- مواد دارویی مصنوعی (شیمیایی) البته به طور سریع اثر می­بخشند و دارای یک تأثیر مشخص نیز می­باشند (ممکن است صرفاً مسکن باشند یا فقط تب بر و یا ...) ولی اکثر آنها عوارض جانبی نامطلوبی بر بدن انسان بر جای می­گذارند. در حالی که مواد دارویی حاصل از گیاهان با آنکه بتدریج تأثیر می­بخشند، ولی اثرهای مفید جانبی داشته و فواید زیادی از نظر دوام سلامت بدن دارند.
4- مواد مؤثره گیاهان، بخصوص عطرها و اسانسها، موارد استفاده متعدد و متفاوتی در صنایع لوازم آرایشی، صنایع مواد شیمیایی خانگی(نظیر: شامپو، صابون، عطر، ادکلن، خوشبو کننده­های هوا و امثال آنها) دارند، بطوریکه بدون حضور مواد مؤثره مذکور، ساخت و تهیه بسیاری از محصولات یاد شده امکان پذیر نخواهد بود(ساخت و تهیه بسیاری از اسانسها به طریق شیمیایی امکانپذیر نیست).
5- استفاده از مواد مؤثره گیاهان دارویی در صنایع غذایی، رشد روزافزون دارد. اگر چه استفاده از مواد مذکور در صنایع غذایی از گذشته معمول بوده، ولی اکنون در صنایع نوشابه­سازی، کنسروسازی، شیرینی­سازی و ... از مواد مؤثره گیاهان دارویی برای بهتر شدن طعم و رنگ و بوی محصولات در سطح دقیق­تر و حساب شده­تری استفاد می­شود.
6- مواد مؤثره دارویی گیاهان ادویه ای(زیره­سبز، تلخون، گشنیز و ...) علاوه بر آنکه طعم و مزه مواد غذایی را بهتر می­کند، اشتهاآور نیز هست و باعث هضم مواد غذایی و سلامت دستگاه گوارش می­گردد. مواد مؤثره ادویه­ها، گاه اثرهای شفابخش دیگری علاوه بر خاصیت اصلی شناخته شده خود دارند.
7- در گذشته، گیاهان دارویی به عنوان منبع اصلی مواد شفابخش، بطور وسیعی توسط مردم مورد استفاده قرار می­گرفت. تا آنکه پس از به بازار آمدن داروهای شیمیایی، استفاده از مواد طبیعی مذکور به طور چشمگیری کاهش یافت؛ ولی در سالهای اخیر، آشنایی علمی و بنیادی انسان با خواص و آثار مفید مواد دارویی طبیعی،زمینه استفاده روزافزون از آنها را فراهم آورده است. به همین دلیل، در عموم کشورهای پیشرفته، مراکز تحقیقاتی خاص گیاهان دارویی تأسیس گشته است که این مراکز تحقیقاتی، هر روز مواد مؤثره متعددی را در گیاهان همراه با اثرهای مطلوب آنها شناسایی و معرفی می­کنند و نتایج حاصل را به صورت مقالات مفیدی منتشر می­سازند(امیدبیگی، 1386).

1-1-5-مواد مؤثره گیاهان دارویی مواد مؤثره گیاهان دارویی دو نوع هستند:
1- مواد حاصل از متابولیسم اولیه یا مواد مورد نیاز و حیاتی که در همه گیاهان سبز با عمل فتوسنتز بوجود می­آید.
2- مواد حاصل از متابولیسم ثانویه که در اثر جذب نیتروژن توسط گیاه تولید می­شود. این تولیدات ظاهراً اغلب برای گیاه بدون فایده هستند، ولی برعکس اثرات درمانی آنها قابل توجه است، منظور از این ترکیبات اسانس­های روغنی، رزین­ها و آلکالوئیدهای مختلف و سایر مواد مؤثره می­باشد.
منظور از سایر مواد مؤثره ترکیباتی چون مواد تلخ، فلاون­ها، فلاونوئیدها، موسیلاژها، ویتامین­ها، تانن­ها،اسید­سالیکسیک و غیره می­باشد که به دلیل ناهمگنی و گستردگی ساختمان­های شیمیایی­شان در سه گروه قبلی جای نمی­گیرند(امیدبیگی، 1386).
1-1-5-1- متابولیت­های ثانویه متابولیت­های ثانویه، مواد آلی شیمیایی پیچیده­ای هستند که گیاهان در طول حیات خود تولید می­نمایندولی در رشد و نمو و فعالیت­های حیاتی آنها نقشی ندارند و عمدتاً به منظور دفع آفات، جذب حشرات، گرده­افشانی و مبارزه با بیماریهای میکروبی در گیاه تولید می­شوند. مواد معطر، مواد مؤثره دارویی، چاشنی­ها، شیرین کننده­های طبیعی، مواد ضد­میکروبی، فرمون­ها، حشره­کش­ها، علف­کش­ها، قارچ­کش­ها، هورمون­های گیاهی و مواد آللوپاتیک از این جمله می­باشند. بر اساس برخی از تخمین­ها حداقل 100000 متابولیت ثانویه از 50000 گونه گیاهی شناسایی شده است و هر سال 4000 متابولیت جدید از واریته­های مختلف گیاهی کشف می­شود(کومار، 2008).
این ترکیبات دارای ساختار شیمیایی پیچیده­تری نسبت به متابولیت­های­اولیه(مثل اسیدهای­آمینه) که برای بقاء زندگی سلولها ضروری­اند می­باشند. آلکالوئیدها(مورفین،کدئین،آتروپین)، ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، رنگیزه­ها و تانن­ها از جمله مهم­ترین این ترکیبات هستند. سلولهای گیاهی مقادیر متنوعی از این فرآورده­ها را تولید می­کنند. بسیاری از این ترکیبات سمی هستند و اغلب در وزیکولهای خاص یا واکوئول­ها ذخیره می­شوند. این نوع ذخیره­سازی از یک طرف نوعی سمیت­زدایی برای گیاه است و از طرف دیگر نوعی مخزن ذخیره برای موادی نظیر مولکولهای غنی از نیتروژن است. اگر چه متابولیت­های ثانویه گیاهی بسیار رایج هستند، اما هر گیاهی قادر به تولید هر نوع ترکیبات ثانویه­ای نیست و برخی ترکیبات نیز تنها منحصر و محدود به گونه خاصی هستند(کومار، 2008).
نقش­های مهم این ترکیبات عبارتنداز:
1- حمایت از گیاهان در برابر گیاه­خواران
2- جلوگیری از آلوده شدن با پاتوژنهای میکروبی
3- ایجاد جاذبه برای جانورانی که در گستراندن دانه­ها و گرده­افشانی نقش دارند(کومار، 2008).
1-1-5-2- طبقه­بندی متابولیت­های ثانویه متابولیت­های ثانویه گیاهان را می توان به سه گروه شیمیایی مجزا تقسیم نمود:
ترپن­ها: ترپن­ها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه متابولیت­های ثانویه را تشکیل می دهند. ترکیبات گوناگون این گروه معمولاً در آب نامحلول هستند. آنها از استیل کوآنزیمA­ یا حد­واسط­های گلیکوزیدی بیوسنتز می­گردند. ترپن­ها در رشد و نمو دخالت دارند، و همچنین در مقابل گیاهخواران نقش دفاعی دارند (تایز و زیگر، 2006).
ترپن­ها سمی بوده و بازدارنده­های تغذیه­ای برای بسیاری از حشرات گیاهخوار و پستانداران می­باشند؛ از این رو می­توانند در سلسله­ی گیاهی نقش­های دفاعی مهمی را ایفا نمایند (گرشن­زون و کروتا، 1992). مثلاً استرهای منوترپنی به نام پیرتروئیدها که در برگ­ها و گل­های گونه داوودی وجود دارند و فعالیت حشره­کشی قابل توجهی را نشان می­دهند. پیرتروئیدهای طبیعی و مصنوعی به خاطر پایداری کم آنها در محیط زیست و سمیت ناچیزشان در پستانداران ازاجزایمعمول حشره­کش­های تجاری هستند. پژوهش­های اخیر چرخش جالبی از نقش ترپن­های فرار را در حفاظت از گیاهان آشکار نموده است. در ذرت، توتون­وحشی، پنبه و گونه­های دیگر بعضی از مونوترپن­ها و سزکوئی­ترپن­ها تنها بعد از شروع تغذیه حشرات تولید و سنتز می­گردند.
این مواد، گیاهخواران تخم­گذار را دفع و دشمنان طبیعی آنها را جذب می­کنند مانند حشرات انگلی و شکارچی که حشرات تغذیه کننده از گیاهان را می­کشند وبنابرایندر کاهش خطرات آینده نقش دارند (کسلروبالدوین، 2001).
بدین ترتیب ترپن­های گیاهی نه تنها از گیاه دفاع می­کنند بلکه زمینه­ای را فراهم می­سازند که از دیگر موجودات نیز برای دفاع کمک گرفته شود.
ترکیبات فنلی: گیاهان گروه بزرگی از فرآورده­های ثانویه را تولید می­کنند که دارای یک گروه فنلی هستند، گروهی کنشگر هیدروکسیلی، که روی یک حلقه آروماتیک قرار دارد. این مواد به عنوان فنلی­ها گروه­بندی می­شوند.
فنلی­های گیاهی از نظر شیمیایی یک گروه نامتجانس متشکل از تقریباً 10000 ترکیب جداگانه هستند. بعضی از آنها فقط محلول در حلال­های آلی هستند و برخی دیگر کربوکسیلیک اسیدها و گلیکوزیدهای محلول در آب و بقیه پلیمرهای نامحلول بزرگ هستند.
گیاهخوارانی که عادت دارند از مواد گیاهی غنی از تانن تغذیه کنند دارای سازگاری­های جالبی برای از بین بردن تاننها در سیستم گوارشی خود شده­اند. بطور مثال برخی پستانداران مانند جوندگان و خرگوش­ها پروتئین­های بزاقی با محتوای پرولین بسیار بالا تولید می­کنند که تمایل زیادی برای ترکیب با تانن ها نشان می دهند.
ترشح این پروتئین­ها با هضم غذاهایی که محتوای تاننی بالایی دارند تحریک می­شود و به مقدار زیادی از اثرات سمی تانن­ها می­کاهد(باتلر، 1989).
ترکیبات نیتروژندار: در ساختمان طیف گسترده­ای از متابولیت­های ثانویه، نیتروژن وجود دارد. ترکیبات دفاعیضدگیاهخواران مانند آلکالوئیدها و گلیکوزیدهای سیانوژنی در این دسته از مواد جای می­گیرند که به علت سمیت آنها در انسان­ها و داشتن خواص دارویی به شدت مورد توجه قرار دارند. اکثر متابولیت­های ثانویه نیتروژندار از آمینو­اسیدهای معمولی ساخته می­شوند.
اینترکیباتشاملالکالوئیدها، گلیگوزیدهای سیانوژنی، گلوکزینولات­ها و آمینو­اسیدهای غیر­پروتئینی و باز­دارنده­های پروتئیناز از گیاه در برابر گیاهخواران و عوامل بیماریزا نقش دفاعی را بازی می­نمایند(تایز و زیگر، 2006).
1-1-5-3- تولید متابولیت­های ثانویه از گیاهان دارویی از لحاظ تاریخی، اگر چه تکنیک کشت بافت برای اولین بار در سال­های 1939-1940 در مورد گیاهان به کار گرفته شد، ولی در سال 1956 بود که یک شرکت دارویی در کشور آمریکا(PFizer Inc)اولین بیمار را از طریق تولید متابولیت­ها با استفاده از کشت توده­ای سلول­ها، درمان کردند. کول و استابوو هبل و همکاران توانستند مقادیر بیشتری از ترکیبات ویسناجین و دیوسجنین[1] را با استفاده از کشت بافت در مقایسه با کشت طبیعی(استخراج از گیاه کامل) به دست آوردند(دیکسون، 2001).
گیاهان منبع بسیاری از مواد شیمیایی هستند که به عنوان ترکیب دارویی مصرف می­شوند. فرآورده­های حاصل از متابولیسم ثانوی گیاهان جزء گرانبهاترین ترکیب شیمیایی گیاهی هستند. با استفاده از کشت بافت می­توان متابولیت­های ثانویه را در شرایط آزمایشگاهی تولید نمود.
1-1-5-4- راهکارهای افزایش متابولیت­های ثانویه گیاهی از طریق کشت بافت
  1. استفادهاز محرک­ها(Elicitors)زنده(مثل مخمر و قارچ) و غیرزنده­ای(مثل اسیدسیتریک و اسید سالیسیلیک و نور و دما) که می­توانند مسیرهای متابولیکی سنتز متابولیت­های ثانویه را تحت تاثیر قرار داده و میزان تولید آنها را افزایش دهند. لازم به ذکر است که این محرک­ها در شرایط طبیعی نیز بر گیاه تاثیر گذاشته و باعث تولید یک متابولیت خاص می­شوند.
  2. افزایش ترکیب اولیه(Precursor) مناسب به محیط کشت، با این دیدگاه که تولید محصول نهایی و در نتیجه وجود این ترکیبات در محیط کشت القاء شود.
  3. افزایش تولید یک متابولیت ثانویه در اثر ایجاد ژنوتیپ­های جدیدی که از طریق استخراج پروتوپلاست یا مهندسی ژنتیک بدست می­آیند.
  4. استفادهازموادموتاژن جهت ایجاد واریته­های پربازده .
  5. کشت بافت ریشه گیاهان دارویی(ریشه نسبت به بافت­های گیاهی دیگر، پتانسیل بیشتری جهت تولید متابولیت­های ثانویه دارد)(امید­بیگی، 1379).
1-1-6- بیوتکنولوژی و کشت بافت گیاهان دارویی در سالهای اخیر با پیشرفت در زمینه بیوتکنولوژی گیاهی و ابداع روش­های مهندسی ژنتیک، اصلاح و کشت تجاری گیاهان و تولید فرآورده­های ثانویه و نیز تولید درون شیشه­ای متابولیت­های ثانویه و دستورزی مسیرهای بیوسنتزی فرآورده­های ثانویه به شدت مورد توجه قرار گرفته است.
روش­های بیوتکنولوژی به خصوص روش کشت بافت و سلول به عنوان روش مکمل در تولید تجاری فرآورده­های گیاهی به شمار می­رود(پورجبار، 1385).
کشت بافت گیاهی در زمینه گیاهان دارویی کاربردهای متعددی دارد که مهمترین آنها عبارتند از:
تکثیره انبوه و سریع گیاهان دارویی یکنواخت از لحاظ محتوای ژنتیکی و کیفی، حفظ گونه­های گیاهی در حال انقراض از طریق نگهداری در شرایط انجماد و تولید متابولیت­های ثانویه در شرایط Invitroاز طریق کشت سوسپانسیون سلولی و کشت اندام.
مهمترینروشهایتکثیر درون شیشه­ایگیاهانریز­ازدیادی،اندام­زاییازطریقکالوسوجنین­زایی سوماتیکی است(تریپاتی، 2003).
علاوه بر این کشت بافت گیاهی یک تکنیک بسیار با ارزش جهت بهبود و توسعه تولیدات گیاهی می­باشد. به کمک این تکنیک این امکان فراهم می­شود که در یک فضای کوچک و محدود با استفاده از ریز­نمونه­های مختلف(ریشه، برگ، ساقه، هیپوکوتیل و....)به سرعت گیاهان زیادی تولید کرد و نیز میتوان در محیط­های کشت مختلف از این ریز نمونه­ها جنین، کالوس، ریشه و..... تهیه نمود.
از سوی دیگر وقوع تنوع سوماکلونال می­تواند منبع دیگری برای بهبود کمیت و کیفیت مواد موثره در گیاهان دارویی باشد(امید­بیگی، 1386).
کشت سلول و بافت به عنوان روش مکمل برای روش­های متداول در تولید فرآورده­های گیاهی می­باشد. استفادهازروش کشت بافت و سلول برای تولید مواد موثره دارویی در میزان مشابه و حتی بیشتر از گیاه کامل در سال­هایاخیر پیشرفت و کاربرد چشمگیری داشته است.
فعالیت بیوسنتزی سلول­های کشت شده می­تواند با دستکاری عوامل محیطی و گزینش لاین­های سلولی وکلون­های مناسب افزایش یابد(راما­چاندرا و راوی­شانکار، 2002).
عوامل متعددی کشت درون شیشه­ای گیاهان دارویی را تحت تاثیر قرار می­دهند از جمله عوامل موثر، تنظیم کننده­های رشدی گیاهی می­باشند. اثرات اکسین­ها و سیتوکنین­ها روی افزایش شاخه­زایی گیاهان دارویی گزارش شده است (تریپاتی، 2003).
1-1-7- هدف از اصلاح گیاهان دارویی اگر چه کاشت گیاهان دارویی به هزاران سال پیش باز می­گردد ولی باید گفت که در مورد اصلاح آنها تاکنون پیشرفت قابل ملاحظه­ای صورت نگرفته است.
وقتی با مقوله اصلاح نباتات سروکار داریم، بطور عمده راه و روشهایی مورد نظر است که با به کار بستن آنها صفات اندامی مشخصی در گیاه تقویت میگردد. و یا، محصولی با کیفیت و کمیت مطلوبتر به دست می­آید. علاوه بر این، ممکن است هدفهای دیگری نیز چون به دست آوردن گیاهان مقاوم در مقابل آفات و بیماریهای خاص، زودرس کردن محصول، انطباق دادن گیاه مورد کشت با مکانیزاسیون پیشرفته و هدفهای مشابه آن مدنظر باشد.
با توجه به این مطلب، هدف از اصلاح گیاهان دارویی نیز افزایش کمیت و کیفیت آن دسته از مواد موثره در این گیاهان است که در صنایع دارویی اهمیت خاصی دارند. از این رو متخصصان فتوشیمی و فارماکوگنوزی، آزمایشهای مخصوص و متعددی را به منظور تعیین خصوصیت مواد موثره دارویی موجود در گیاهان باید انجام دهند.
همچنین دراصلاحگیاهانداروییبهدستآوردن کولتیوارهای مورد نظر، نه تنها باید خصوصیات کمی و کیفی مواد موثره از نظر نیازهای خاص صنایع دارویی مورد توجه قرار گیرد، بلکه کولیتوارهای اصلاح شده باید از مشخصات زیر نیز برخوردار باشند:
مقاومت به آفات و بیماریها، سرعت رشد و نمو اندام محتوی ماده موثره، دوام کافی اندام مذکور از نظر استحصال، هماهنگی و همزمانی رشد و نمو اندامهای مورد استحصال، قابل جمع­آوری بودن محصول با ماشین، فقدان اعضای مزاحم استحصال چون خارهای موجود در ساقه، برگ، میوه و غیره.
علاوه بر اینها در کشت گیاهان دارویی، می­توان به تولید انبوه محصول اندامی که محتوی مقادیر بسیار کم از ماده موثره خاصی است، یا(به عکس) به تولید کمتر از انبوه اندامی که همان ماده موثره را بیشتر تراوش می­دهد توجه نمود.
بنابراین اصلاح گونه­های مختلف گیاهان دارویی بیش از همه باید در جهت تامین نیازهای صنایع دارویی باشد و نظر اصلاح کنندگان گیاهان دارویی نیز امروزه بیش از پیش به نیازهای مذکور معطوف شده و با تغییرات هدفمندی که در چرخه­های متابولیکی گیاهان به وجود می­آورند، علاوه بر اینکه سرعت و مقدار سنتز مواد موثره مورد بحث را افزایش می­دهند باعث کاهش یا از بین رفتن مواد زاید و غیر مفید موجود در مواد موثره نیز می­گردند.
اصلاح کنندگان گیاهان دارویی، باید شناخت کاملی نسبت به کمیت و کیفیت مواد موثره آنها داشته باشند؛ در غیر این صورت، عمل اصلاح با مشکل رو به رو خواهد شد.
برای اصلاح گیاهان دارویی از روشهای تحقیقی جدید همانند کشت بافت و سلول گیاهی نیز استفاده می­کنند. دلایل استفاده از روش مذکور، عبارت است از: به دست آوردن گیاهان همانند و همگن، ایجاد گیاهان غیر همانند و ناهمگن، ایجاد جهش، ویروس­زدایی و باکتری­زدایی از گیاه، اصلاح گیاهان از نظر مقاومت به بیماری و آفات و امثال این موارد است(امید­بیگی، 1386).
1-2- بارهنگ
1-2-1- رده­بندی علمی بارهنگ Kingdom: plantae
Division : Magnoliophyta
Class: magnolipsida
Order : Lamiales
Family: plantaginaceae
Jenusp : antogo
Pecies: P.major
1-2-2- تاریخچه بارهنگ بارهنگ از دیرباز در دسترس بشر بوده و در کشارورزی مصرف می­شده است. رویش گونه­های خاصی از بارهنگ، همراه با سکنی گزیدن انسان در مناطق مختلف (به ویژه در مستعمرات اروپایی) افزایش یافته است.سرخپوستانآمریکای شمالیو مائورهای نیوزیلند، بارهنگ را ردپای مرد انگلیسی English man s footمی­نامند؛ زیرا رویش آن از نواحی مربوط به مستعمره­های انگلیسی آغاز شد.
گونه­های بارهنگ در درمان­های گیاهی کاربرد داشت و گاهی نیز به همین منظور به مستعمره­ها برده می­شد. دانه بارهنگ در تفاله مالت (که قبلاً به عنوان کود مصرف می­شد) و پشم صادر شده به انگلیس دیده شده و کاربرد آن در خوراک طیور متداول بود.

1-2-3- خصوصیات گیاه­شناسی بارهنگ 1-2-3-1- اختصاصات ظاهری گونه گیاه بارهنگ با نام علمی Plantago majorl.جزء خانواده Plantaginaceae می­باشد. بارهنگ گیاهی است چند ساله، ساقه آن بطول 10-70 سانتی­متر، برگ­های بارهنگ بیضی شکل و تماماً طوقه­ای است، دارای دمبرگ­های بلند هستند که از این گیاه خارج می­شوند.
در پهنگ این برگ­ها 3 تا 11 رگبرگ سراسری در طول برگ به خوبی نمایان است. گل­هایش کوچک و به صورت اجتماع سنبلهاستوانه­ای، در انتهای ساقه قرار گرفته­اند و به رنگ سبز متمایل به قهوه­ای هستند. که سپس به میوه و دانه­هایی که بر روی همین محور قرار دارند تبدیل می­شوند (امین، 1384).
موسم گلدهی گیاه اردیبهشت تا شهریور است. قسمت مورد استفاده گیاه، برگ و دانه و ریشه آن است ودانه­های آن کوچک، تخم مرغی و به رنگ قهوه­ای تیره هستند و در میوه­ای پوستینه که به صورت کپسول تخم­مرغی بوده و دارای دو خانه و محتوی 8-4 دانه است قرار دارند.
دانه­ها را از اواسط فصل بهار به بعد جمع­آوری می­نمایند. این گونه بارهنگ دارای برگ­های پهن و بزرگ است که بر روی سطح زمین قرار گرفته­اند.
گیاهان تیره بارهنگ وضع پراکنده ای در نقاط مختلف کره زمین دارند و از سه جنس
  1. Plantago Psyllium
  2. Plantago coronopas.L .
  3. Plantago Major L.
و متجاوزاز 200 گونه تشکیل شده اند.
تعداد بیشتر گونه­های بارهنگ نیز به جنسPlantago تعلق دارد. گیاهان این گونه عموماً علفی و به ندرت دارای اعضای کم و بیش چوبی شده می­باشند.
در بین آنها انواعی که تعلق به جنس Plantagoدارند نیز کم و بیش استفاده­های درمانی به عمل می­آید به صورت کاملاً متمایز از یکدیگر دیده می­شوند گلهای آن­ها منظم مرکب از قطعات 4 تایی نر – ماده یا دارای یکی از اجزای اصلی گل (پرچم یا مادگی) به رنگ­های مختلف مجتمع بصورت سنبله­های فشرده یا استوانه­ای شکل است.
مادگی آنها از 2 برچه (بندرت یک برچه) تشکیل می­یابد که مجموعاً تخمدانی 2 خانه یا یک خانه و محتوی یک یا تعداد زیادی تخمک غیر­واژگون با تمکن محوری بوجود می­آورند در بعضی از این گیاهان نیز پیدایش جدارهای فرعی در داخل تخمدان سبب ازدیاد خانه­های آن می­شود.
گیاهان متعلق به این خانواده، علفی، خشبی، یک ساله یا چند ساله می­باشند از مهمترین صفت آنها، وجود رگبرگهای موازی (نظیر تک­لپه­ایها) در طول برگهاست. گلها دارای چهار پرچم هستند. در میان گیاهان این تیره، گیاهان دارویی و همچنین علف­های هرز مشاهده میشود (امید­بیگی، 1384).
1-2-4- چند گونه از خانواده­های بارهنگ
  1. Plantago Lanceolata : این گونه در کتب طب سنتی با نام لسان­الحمل صغیر ذکر می­شود و فارسی آن بارهنگ نیزه­ای است این گیاه چند ساله است و بدون ساقه می­باشد. برگهای آن دراز و نیزه­ای نوک تیز که دارای 5-3 رگبرگ مشخص است میوه آن به شکل کپسول وکمی دراز است در آن 2 دانه قرار دارد.
  2. Plantago medial: گیاهی است چند ساله بدون ساقه برگها همه از ریشه خارج شده­اند و در هر دو سطح پوشیده از کرک، تخم­مرغی و دارای 9-5 رگبرگ مشخص هستند.
  3. Plantago coronopusl: گیاهی است یکساله و دو ساله و در برخی مناطق چند ساله بدون ساقه و کم و بیش پوشید از کرک، برگهای دراز، مثلثی با بریدگی که همه از ناحیه یقه ریشه بیرون آمده­اند.
  4. Plantago crassiflia Forsk: از نظر شکل کم و بیش شبیه سایر گونه­هاست. این گیاه بیشتر در سواحل شنزار می­روید.
1-2-5- محل رویش و پراکندگی طبیعی بارهنگ بارهنگ معمولاً در ارتفاعات بکر، زمین­های کشت نشده، چمنزارها، بستر رودخانه­ها، حاشیه­ی جاده­ها و زمین­های بایر پیدا می­شود.
بارهنگ گیاه بومی اروپاست که از آنجا به دیگر مناطق معتدل جهان از جمله آمریکای شمالی نیز برده شده است. در منطقه وسیعی از دو قاره اروپا و آسیا و همچنین شمال آفریقا و آمریکای شمالی می­روید. در ایران تقریباً در تمام نقاط می­روید ازجمله: اطراف تهران – کرج- لاهیجان – رشت – گرگان- مازندران- کندوان- آذربایجان­شرقی – ارومیه – کرمانشاه – خرم­آباد – همدان – بروجرد – کرمان – شیراز – خراسان – بجنورد – کاشان – اصفهان – بلوچستان و کردستان .
1-2-6- نیازهای اکولوژیکی بارهنگ بارهنگ خاکهای شنی لومی را ترجیح می­دهد و نیازمند خاکهای زهکشی شده است. این گیاه در خاکهای مرطوب و مناطق آفتابگیر به خوبی رشد می­کند. بارهنگ به سرمازدگی حساس نبوده و تا دمای 5 درجه سانتیگراد را به خوبی تحمل می کند.
این گیاه از طریق بذر تکثیر می­شود. بخاطر این که این گیاه یک گیاه خودرو است مقدار بذر و فواصل کاشت و سیستم کاشت این گیاه طبیعی است.
روش کاشت
بارهنگ را در هوای سرد(اوایل بهار) کشت می­کنند و زمانی که به اندازه کافی رشد کرد (اوایل تابستان) به زمین اصلی منتقل می­کنند. در صورتی که بذر به اندازه کافی در دسترس باشد می­توان این گیاه را در اواخر بهار یا اوایل تابستان کشت نمود. کشت این گیاه در زمین­های کمی حاصلخیز و نواحی آفتابگیر موفقیت­آمیز است.
اندام مورد استفاده : برگ، دانهو ریشه است.
دوره آبیاری: این گیاه یک گیاه دیمی محسوب می­شود و با بارندگی آبیاری می­شود.
طول مدت جوانه­زنی: بذر این گیاه در 10 تا 15روز جوانه می­زند. pH خاک مناسب با بافت سبک با 6-7 بهترین رشد و نمو را دارد.
زمان برداشت: از خرداد تا شهریور ماه است و تعداد چین در سال فقط یکبار از برگ و دانه آن برداشت می­شود.
بهترین زمان برداشت برگها اصولاًاواخربهاروتابستان (خرداد تا شهریور) می­باشد. ریشه­ها نیز معمولاً در بهار یا تابستان برداشت می­شوند.
بارهنگ یک گیاه خودباروراست، بارهنگ دارای بیشترین خودگشنی می­باشد و بین 0 تا 8% دگرگشنی گزارش شده است(ولف، 1991).
1-2-7- ترکیبات بارهنگ برگ و ریشه بارهنگ دارای موسیلاژ به میزان حدود 6/5 درصد که حاوی دست کم چهار پلی­ساکارید می­باشد صمغ، اسیدهای آلی، تانن، انورتین، امولسیون و گلیگوزیدی به نام آکوبین، دیاستاز، هتروزید، مواد رنگی، ساکارز(در بذر) ، پکتین، اسید­سیتریک، ساپوزید(در برگ) همچنین در بذر بارهنگ مقدار زیادی مواد گلوتینی، اسید­پلانتئونولیک، اسید­سوکسینیک، آدنین، کولین و هولوزیدپلانتئوز وجود دارد و نیز بذر بارهنگ حدود 10 درصد مواد روغنی دارد، روغن بارهنگ زرد رنگ است و بویی مطبوع و طعمی شبیه روغن گردو دارد و در خاکستر آن املاح مختلف سدیم، منیزیم، پتاسیم به طور فراوان موجود است (فیضثانی و همکاران، 1391).
1-2-8- خواص درمانی بارهنگ گل بارهنگ برای انسان استفاده ندارد، اما مورد علاقه زنبورهاست. عسلی که زنبورها از گل بارهنگ درست می­کنند، نبات بارهنگ گفته می­شود که در کشورهای اروپایی، یکی از بهترین داروها برای رشد و نمو اطفال است.
از این گیاه برای ناراحتیهای تنفسی استفاده می­شود و یکی از گیاهان لعاب­دار و دارای ماده سافورین است. کمک به تصفیه خون، تببری، ضد اسهال بودن، کاهش دهندهدردهای رماتیسمی، ضد­التهاب کلیه و مثانه وخاصیت ضد­میکروبی از کاربردهای مهم بارهنگ می­باشد(فیض­ثانی، 1391).
بعلاوه از این گیاه میتوان در درمان خونریزی های ریوی– عفونتهای مجاری تنفسی، التهاب چشمی، التهابات روده­ای، بیماریهای کبدی و مالاریا استفاده کرد.
همه بخش­های گیاه بارهنگ شامل برگ و ریشه و دانه­ی آن، مصارف دارویی دارد اما برگ و ریشه آن را بیشتر بصورت استعمال خارجی و بذر بارهنگ را بیشتر بصورت مصارف داخلی استفاده می­کنند.
برگ بارهنگ تببر و آرامبخش است و برای درمان مالاریا و تسکین سرفه و اختلالات کلیه و آسم برونشیتی و درمان بیماریهای کلیه و مثانه موثر می­باشد(وهابی و همکاران، 2008)
از ترکیبات موجود در دانه بارهنگ می­توان به موسیلاژ کهاز بهترین هیدروکلوئیدهای پلی­ساکاریدی دارویی بودهو در مقایسهباهیدروکلوئیدهای پلی­ساکاریدی دیگر نسبت به pH پایین مقاوم می­باشد، اشاره نمود.
جوشانده و دم­کرده موسیلاژ برای تورم مخاط مفید بوده و برای درمان تورم­های مجاری تنفسی و معده مناسب است (اشرف ، 2004).

1-3- کاربرد­های مهم کشت بافت در اصلاح نباتات
- ریزازدیادی برخی گونه­ها نظیر گلها و گیاهان زینتی، دارویی و یا درختان مثمر و غیر­مثمر که در شرایط معمولیInvivo) )مشکل دارند و به سختی تکثیر می­شوند.
- کشت بساک، دانه گرده و یا تخمک برای تولید گیاهان دابل­ها­پلوئید.
- نجات جنین برای رفع موانع موجود در دو­رگ­گیری بین جنین­ها و گونه­های مختلف گیاهی.
- حفاظت از ذخایر ژنتیکی در شرایط انجماد برای نگهداری طولانی مدت ژرم­پلاسم­های گیاهی.
- ایجاد تنوع سوماکلونال و استفاده از آن برای گزینش گیاهان با صفات جدید.
- دو­رگ­گیری سلول­های سوماتیکی یا دو­رگ­گیری غیر­جنسی برای تولید هیبرید و سیبرید.
- استفاده از انواع کشت سلولی برای تولید و افزایش میزان مواد دارویی و سایر ترکیبات با ارزش .
- بهره­گیری از کشت بافت در مهندسی ژنتیک برای تولید گیاهان ترا­ریخته مقاوم به تنش­ها (عبدالطف ،2008).

1-4- تنوع سوماکلونال[2]
1-4-1- تنوع سوماکلونال در کشت بافت گیاهی تغییرات ژنتیکی مشاهده شده بین نسلهای گیاهان جدید حاصل از کشت سلولهای سوماتیک در شرایط آزمایشگاهی به عنوان تنوع­های سوماکلونال تعریف می­شود. کشت بافت گیاهی اصولاً روشی برای کلون کردن ژنوتیپهای خاص می­باشد و همیشه این فرض مورد قبول بوده است که تمام گیاهان حاصل از کشت بافت کپی­های دقیقی از والدین می ­باشند ولی گاهی محققان به تنوع­های فنوتیپی در بین گیاهان باززایی شده پی می­برند که اغلب از این تنوع­ها چشم پوشی می­شود (احسان­پور و امینی، 1380).
جانیک و اسکیروین[3] اولین کسانی بودند که در سال 1976 به اهمیت تنوع سوماکلونال در اصلاح ژنوتیپ گونه­های باغبانی تاکید کردند. در واقع گیاهانی که از کشت سلول و بافتها باززایی می­شوند، در بعضی موارد از گیاهانی که از آن منشاء گرفته­اند متفاوت می­باشند.
البته نتاج این گیاهان باززا شده ممکن است به نوع والدینی برگشت نمایند. لارکین واسکوکرافت[4] در سال 1981 واژه تنوع سوماکلونال را به عنوان واژه­های عمومی برای تنوع بین گیاهان باززایی شده و سلولها و بافتهای کشت شده معرفی نمودند(احسان­پور و امینی، 1380).
تنوع سوماکلونال فرایندی است که منجر به تغییرات ژنتیکی جدا­کشتها شده و تنوع خاصی را ایجاد می­نماید. این تغییرات ژنتیکی پاره­ای از تغییرات دیگر از جمله تغییر در مورفولوژی، بیوشیمی وامثال آن را به دنبال دارد.
تنوع سوماکلونال در گیاهان به طور عمده پس از کشت بافت در بعضی از سیستمهای باززایی گیاه که در آن گیاه مرحله کالوس را طی می­کند دیده می­شود. در واقع تنوع سوماکلونال نوعی ناپایداری ژنتیکی جدا کشتها بوده و از مشکلات کشت بافت می­باشد ولی می­تواند به عنوان یکی از روشهای اصلاح نباتات نیز بکار رود (احسان­پور و امینی، 1380).

1-4-2- منشاء و چگونگی ایجاد تنوع سوماکلونال تنوع سوماکلونال را می­توان در دو دسته طبقه­بندی نمود: تغییرات ژنتیکی (وراثتپذیر) که در اثر وقوع جهش یا سایر تغییرات DNA به وجود می­آیند و قابل انتقال به نسل­های بعدی هستند و تغییرات اپی­ژنتیکی (وراثت ناپذیر) که در نتیجه تغییرات فنوتیپی موقت ایجاد می­شوند.
1-4-2-1- تغییرات ژنتیکی(وراثت پذیر) تغییرات ژنتیکی شامل تغییرات دائمی در ژنوم گیاه بوده و به ایجاد گیاهانی با ژنوتیپ جدید منجر می­شود. برخی از این تغییرات به آسانی قابل تشخیص می­باشند، مثل تغییر شکل برگ و یا جهش در کلروفیل که به تولید گیاه زال (فاقد کلروفیل) می­انجامد، در حالی که سایر تغییرات ژنتیکی که بر روی عادت رشد، قدرت رشد و یا قابلیت تولید انرژی اثر می­گذارند، ممکن است به آسانی تشخیص داده نشوند. فرآیندهای ملکولی متفاوتی مسئول تغییرات ژنتیکی مرتبط با تنوع سوماکلونال هستند که عبارتند از:
1-4-2-1-1- تغییر در سطح پلوئیدی یکی از متداول­ترین انواع تنوع سوماکلونال در اثر تغییر در تعداد کروموزوم­ها و به صورت پلی­پلوئیدی، آنیوپلوئیدی یا میکسوپلوئیدی (پلوئیدی مخلوط) می­باشد.
پلی­پلوئیدی شامل تغییر در تعداد سری کامل کروموزوم­های پایه می­باشد، در حالی که آنیو­پلوئیدی شامل تغییر در تعداد برخی از کروموزوم­ها است، به طوری که تعداد یک کروموزوم خاص به جای دو عدد، کمتر یا بیشتر خواهد بود.
میکسو­پلوئیدی به حالتی اطلاق می­شود که در آن یک گیاه محتوی سلول­هایی با سطوح پلوئیدی متفاوت (به عنوان مثالx3+x2) می­باشد.
تغییر در سطح پلوئیدی در اثر فرآیندهای غیر معمول در هنگام تقسیم میتوز اتفاق می­افتد. برای مثال، می­توان به تکثیر بیش از حد کروموزوم­ها طی مرحله اینترفاز، ادغام رشته­های دوکی یا عدم تشکیل رشته­های دوکی و عدم تقسیم سیتوپلاسم اشاره نمود.
با رشدسلول­های گیاهی و پیر شدن آنها احتمال تغییرات پلوئیدی افزایش می­یابد. بنابراین، می­توان تغییرات پلوئیدی را که در نمونه­های کشت شده و گیاهان باززاشده از آنها مشاهده می­شوند، به منابعی که ریز­نمونه­های گیاهی از آن به دست آمده­اند، مربوط دانست.
عامل دیگری که باعث تغییر در سطح پلوئیدی می­شود، شرایط درون شیشه محیط کشت می­باشد. هر چه سلول­ها مدت زمان بیشتری در محیط کشت باقی بمانند، پایداری کروموزوم­های آنها نیز کاهش می­یابد.
همچنین، انجامواکشت­هایمکرر فراوانی تغییرات پلوئیدی را افزایش می­دهد. علاوه بر این، ترکیب محیط کشت نیز می­تواند موجب ایجاد تغییرات پلوئیدی شود.
برای مثال، کینتین و 2,4-Dهر دو در ایجاد تغییرات پلوئیدی نقش دارند. همچنین، نمونه­هایی که در شرایط کمبود مواد تغذیه­ای قرار داشته­اند، رشد غیر­عادی از خود نشان می­دهند. گزینش صحیح ریز­نمونه و محیط کشت مناسب، می­تواند تا حد زیادی در افزایش پایداری کروموزومی موثر باشد، با این وجود تغییرات گسترده سطوح پلوئیدی در نمونه کشت شده همیشه منجر به افزایش فراوانی تنوع سوماکلونال در گیاه باززاشده نمی­شود؛ زیرا در یک محیط کشت سلول­های دیپلوئید نسبت به سلول­های آنیوپلوئید و یا پلی­پلوئید و یا میکسو­پلوئید بهتر با شرایط باززایی سازگار می­شوند و تشکیل هر سیستم از این سلول­ها نیز محتمل­تر است (اثنی­عشری و خسرو­شاهی، 1388).
1-4-2-1-2- تغییرات ساختمانی در DNA هسته­ای تغییرات ساختمانی در DNA هسته­ای عامل اصلی ایجاد تنوع سوماکلونال است. این تغییرات می­تواند محدوده وسیعی از سطح کروموزوم را دستکاری کند و یک یا چند ژن را در یک زمان تحت تاثیر قرار دهد. این دستکاری­ها شامل انواع نوترتیبی ساختمانی شامل حذف شدگی(از دستدادن تعدادی ژن)، وارونگی (تغییر در حالت ژن)، دو برابر شدن ژنها و جابجایی (تغییر مکان قطعه­ای از کروموزوم) می­باشد.
فعال شدن ترانسپوزون[5]­ها(یا عناصر جهنده)، عامل دیگر تنوع سوماکلونالاست. ترانسپوزون­ها قطعات متحرکی از DNA هستند که توانایی درج در نواحی کد­کننده را دارند و موجب تخریب ژن می­شوند.
علاوه بر این تغییرات وسیع که در سطح توالی DNA هسته­ای رخ می­دهند، تغییر در سطح تک نوکلئوتید واقع در ناحیه کد کننده نیز باعث ایجاد تنوع سوماکلونال می­شود.
برای مثال، جهش­های نقطه­ای که در نتیجه تغییر نوع باز در یک نوکلئوتید و یا متیله شدن آن ایجاد شده است، نیز ممکن است به غیر­فعال شدن ژن بی انجامد(اثنی­عشری و خسروشاهی، 1388).

1-4-2-1-3- نوترتیبی شیمری[6] بسیاری ازگیاهان زراعی و باغبانی شیمرهای پری­کلینال (لایه­ای ) هستند، به طوری که ترکیب ژنتیکی هر یک از لایه­های سلولی متحدالمرکز مریستم(مثلاً مریستم انتهای ساقه) در آنها متفاوت است. این لایه­ها توانایی نوترتیبی در هنگام تکثیر سلولی را دارند، بنابراین گیاهان باززا شده ممکن است ترکیب شیمری متفاوتی داشته باشند و یا به طور کلی دیگر شیمر نباشند.
احتمال دارد که روند نوترکیبی جوانه انتهایی ساقه باعث ایجاد گیاهان تراریخت شیمری گردد (اثنی­عشری و خسرو­شاهی، 1388)
1-4-2-2- تغییرات اپی­ژنتیکی(وراثت ناپذیر) تغییرات اپی­ژنتیکی آنهایی هستند که ظاهراً کم و بیش ثابت بوده و با تداوم ازدیاد رویشی باقی می­مانند، اما دخالتی در تغییرات دائم ژنوتیپ ندارند.
تغییرات اپی­ژنتیکی که باعث ایجاد تنوع سوماکلونال می­شوند، اغلب موقتی و غیر قابل انتقال به نسل­های بعدی بوده و طی زمان برگشت­پذیر هستند، گرچه گاهی نیز در طی زندگی گیاه باززا شده، پایدار باقی می­مانند. تغییرات اپی­ژنتیکی به هنگام تشکیل یک جنین انتقال داده نمی­شوند، در حالی که صفات ژنتیکی منتقل می­گردند.
یکی از متداول­ترین تغییرات فنوتیپی که در طی مراحل کشت بافت در گیاه مشاهده می­شود، بازجوانی (بازگشت به دوره نونهالی) است.
بازجوانی سبب ایجاد تغییراتی در ظاهر گیاه، همچون جلو افتادن زمان گلدهی و افزایش ریشه­زایی نابجا می­شود. مشخص شده است که تغییرات مرحله نونهالی به بلوغ در گیاهان به صورت اپی­ژنتیکی کنترل می­شود.
ریز­نمونه­هایی که از قسمت­ها و اندام­های مختلف یک گیاه گرفته می­شوند، ممکن است حالات اپی­ژنتیکی مختلفی از خود نشان دهند. به عنوان مثال، نشان داده شدهاست که کشت­هایکالوسی که از مراحل بلوغ ونونهالی گیاهعشقه گرفته شده­اند، دارایویژگی­هایرشدی متفاوتی بودهاند که حتی طی چند واکشت نیز باقی مانده است.
با تداوم واکشت­های بافت کالوس، ممکن است سلول­های آن توانایی اندام­زایی یا جنین­زایی خود را از دست بدهند. در موارد دیگر، نحوه تغییرات برعکس شده است که این امر حاکی از بروز تغییر اپی­ژنتیکی می­باشد. در برخی از موارد، بافت­های کشت شده نیازهای خود را برای تنظیم کننده­هایی مثل اکسین و یا سایتوکینین از دست می­دهند. این پدیده که خوگیری نامیده می­شود، نمونه­ای از تغییرات اپی­ژنتیکی است.
1-4-3- کنترل تنوع سوماکلونال کنترل تنوع سوماکلونی به معنی توانایی در جلوگیری از وقوع یا افزایش تنوع برحسب اهداف کشت بافت است که این موضوع در کشت بافت و کاربرد آن بسیار حائز اهمیت است. عوامل گوناگونی شناسایی شده­اند که درجه تنوع سوماکلونی را در ریز­نمونه­های اولیه و در سطح اندام­زایی کشت­های بافت تعیین می­کنند. وقوع تنوع سوماکلونی با انتخاب ریز نمونه از گونه­های غیر پلی­سومیک، انتخاب ریز­نمونه از بخش­های مریستمی، استفاده از بافت­های جوان­تر و بنا به ضرورت ساختارهای تمایز نیافته­ای چون برگ­ها به حداقل می­رسد.
در این روش تنوع سوماکلونی ناشی از بافت­های والدینی درحد امکان پایین نگه داشته می­شود. در کشت­های بافت مختلف مشخص شده است که هر چه بافت مورد استفاده سازمان یافته­تر باشد، تنوع سوماکلونی در آن کمتر است، از این رو، بیشترین تنوع در پرتوو­پلاست­های گیاهی و کمترین آن در کشت مریستم یا جوانه انتهایی دیده می شود.
کاهش زمان کشت بافت، درصد سلول­های از بین رفتنی و غیر­طبیعی را کم می­کند. به نظر می­رسد که در آغاز کشت بافت، چرخه سلولی دچار اختلال شده و به همین دلیل سلول­ها خیلی سریع تقسیم می­شوند که این موضوع به قطعه قطعه شدن یا شکستگی در کروموزوم می­انجامد، بنابراین کاهش سرعت تقسیم از راه کاهش درجه حرارت یا تغییر سطح تنظیم کننده­های رشد در محیط کشت موجبات کاهش سطح تغییرات احتمالی در بافت­ها را فراهم می­کند.
از طرف دیگر به منظور افزایش سوماکلو­ن­ها می­توان این محدودیت­ها را برطرف کرد(سیدطباطبایی و امیدی، 1388).
روشهایمتعددیبرایکاهش و اجتناب از تنوع سوماکلونال وجود دارد. به خوبی مشخص شده است که افزایش تعداد دفعات واکشت احتمال تنوع سوماکلونال را افزایش می­دهد، بنابراین، لازم است که در برنامه­های ریز­ازدیادی تعداد واکشت­ها تا حد امکان کاهش یابد.
استفاده از ریز­نمونه­های جدید در هر کشت و آغازش و ایجاد کلونی از آنها می­تواند تغییرات سوماکلونال را کاهش دهد.
روش دیگر برای کاهش تنوع سوماکلونال اجتناب از به کار بردن 2,4-Dدر محیط کشت است، چرا که نشان داده شده است که این هورمون سبب ایجاد تنوع سوماکلونال می­شود(اثنی­عشری و خسرو­شاهی، 1388).

1-4-4- کاربرد تنوع سوماکلونال در اصلاح نباتات مهم­ترین فایدهو کاربرد تنوع سوماکلونال در اصلاح نباتات می­باشد. تنوع سوماکلونال منجر به افزایش تنوع ژنتیکی گیاهان می­شود. از جمله صفات مطلوبی که ممکن است طی کشت درون شیشه­ای در تغییر یافته­های سوماکلونال القاء یا تقویت گردد، عبارتند از مقاومت به ترکیبات سمی ناشی از عوامل بیماری­زا، تنش­های محیطی و شیمیایی و افزایش تولید متابولیت­های ثانویه(اثنی­عشری و خسرو­شاهی، 1388).
نتایج باززایی شده همیشه از نظر مورفولوژیکی تنوع زیادی نشان می­دهند، ولی بیشتر آنها در اولین نتایج بذری از دست می­روند. تنوع سوماکلونال در همه صفات گیاهی ممکن است ظاهر شود، ولی همه آنها از نظر زراعی مفید نیستند، بنابراین با استفاده از انتخاب می­توان فقط لاین­های مفید را از منبع تنوع جدا و تکثیر کرد.
با استفاده از روش تنوع سوماکلونال و انتخاب لاین­های مطلوب، گوجه فرنگی­هایی با ماده خشک زیاد، ذرت مقاوم به علف کش کلروسولفوران، افزایش تحمل به علف کشدر ذرت، تحمل به قارچ هلمینتوسپوریوم در گندم و جو، ومقاومت به شوری در کتان اصلاح شده­اند. همچنین تحمل به سرما و یخبندان، کیفیت دانه و ترکیبات پروتئینی در گندم و بذرهای سنگین تر با درصد پروتئین بیشتر در برنج اصلاح شده است(سید­طباطبایی و امیدی، 1388)
با وجود نقش مثبت انواع تنوع سوماکلونال در اصلاح نباتات، باید به خاطر داشت که پیشرفت­های اصلی و با ارزش در نباتات زراعی از راه روش­های کلاسیک اصلاحی حاصل شده است.
بنابراین روش­هایی همچون تنوع سوماکلونال باید همراه با روش­های کلاسیک اصلاحی به کار گرفته شود(طباطبایی و امیدی، 1388).

1-5- نشانگر (مارکر)
بطور کلی هر صفت یا خصوصیتی که بتواند بعنوان علامت شناسائی فرد دارند آن صفت یا خصوصیت بکار رود یک مارکر است. برای آنکه بتوان از صفتی بعنوان یک مارکر ژنتیکی استفاده نمود آن صفت باید حداقل دارای دو ویژگی باشد که این دو ویژگی عبارتند از :
  1. چند شکلی (پلی مورفیسم) داشته باشد. یعنی بین دو فرد مختلف، متفاوت باشد.
  2. از نسلی به نسل دیگر به ارث برسد.
1-5-1- انواع نشانگر­های ژنتیکی بطور کلی نشانگرهای ژنتیکی را می­توان به دو دسته کلی نشانگرهای مورفولوژیک و نشانگرهای مولکولی تقسیم بندی نمود.

1-5-1-1-نشانگر­های مورفولوژیک به یک صفت مورفولوژیک که عمدتاً توسط یک یا چند ژن کنترل می­شود و در یک جمعیت، میتوان افراد مختلفی را پیدا کرد که از نظر آن صفت با هم اختلاف داشته باشند یک مارکر مورفولوژیک گفته می شود.
در حقیقت نشانگرهای مورفولوژیک را می­توان نتیجه جهش­های ژنی قابل مشاهده در شکل ظاهری یک موجود تلقی نمود.
اینگونه مارکرها دارای معایب فراوانی هستند که چند نمونه از این معایب عبارتند از:
  1. تحت تاثیر شرایط محیطی قرار می­گیرند.
  2. تنوع و فراوانی کمی دارند.
  3. برای مشاهدهآنها گاهیاوقات باید مدت زیادی صبر کرد.

1-5-1-2- نشانگر­های مولکولی نشانگرهای مولکولی خود به دو گروه بزرگ نشانگرهای پروتئینی و نشانگرهای DNA طبقه­بندی می شوند. اساس کار نشانگرهای مولکولی بر پایه الکتروفورز استوار است.
1-5-1-2-1- نشانگر­های پروتئینی از حدود 40 سال قبل محققین دریافتند که استفاده از پلی­مورفیسم پروتئینی می­تواند در مطالعاتی مولکولی در زمینه اصلاح نباتات مفید باشد آیزوزایم­ها گروهی از مارکرهای پروتئینی هستند.
طبق تعریف آیزوزایم­ها عبارتند از فرمهای مولکولی مختلف یک آنزیم که فعالیت یکسانی را کنترل می­نمایند. بعبارت دیگر، آیزوزایم­ها اشکال مختلف الکتروفورزی یک آنزیم می­باشند.
آیزوزایم­ها در مقایسه با مارکرهای مولکولی دیگر دارای معایبی هستند که کاربرد آنها را در مطالعاتی مولکولی محدود ساخته است.
یکی از بزرگترین معایب این گروه از مارکرهای مولکولی فراوانی کم آنهاست به گونه­ای که تعداد آیزوزایم های قابل استفاده به عنوان نشانگر به زحمت به صد عدد می­رسد. علاوه بر این، تنوع و پلی­مورفیسم قابل ثبت و استفاده در آیزوزایم ها نیز به اندازه­ای نیست که قابل مقایسه با دیگر مارکرهای مولکولی باشد.
بنابراین این گروه از مارکرهای مولکولی به نوعی دارای یکی از معایب مارکرهای مورفولوژیک یعنی تنوع و فراوانی پائین می باشند. یکی دیگر از معایب این گروه از مارکرهای مولکولی آنست که بعلت پیچیده بودن الگوهای الکتروفورزی آیزوزایم­ها تجزیه و تحلیل نتایج بدست آمده از آنها بسیار مشکل می باشد، لازم به ذکر است که نحوه توارث این مارکرها بصورت همبارز می باشد.
1-5-1-2-2- مارکرهای DNA مارکرهای DNAگروه بزرگ دیگری از مارکرهای مولکولی هستند که به دلیل دارا بودن کاربردهای فراوان در انواع مطالعات مولکولی، امروزه در سطح گسترد­ه ای مورد استفاده پژوهشگران شاخه­های مختلف علوم زیستی قرار می گیرند.
اگر چه این گروه از مارکرها از حدود 30 سال گذشته بصورت عملی وارد عرصه تحقیقات مولکولی شده­اند اما در همین مدت کوتاه تاثیر شگرفی بر پیشرفت مطالعات مولکولی­داشته­اند.
با استفاده ­از مارکرهای DNAامکان بررسی تنوع ژنتیکی در بین افراد جوامع مختلف گیاهی با سرعت و دقت بیشتری فراهم می گردد.
همچنین با کمک این مارکرها میتوان با کاوش در ژنوم یک گونه یا نژاد خاص، از وجود یا عدم وجود ژنهای مورد نظر در آن آگاه شد در واقع مارکرهای DNAتفاوتهای افراد مختلف یک جمعیت را در سطح ژنوم آشکار میسازند و به همین دلیل دارای فراوانی و پلی­مورفیسم بسیار زیادی هستند.
تا به امروز انواع مختلفی از مارکرهای DNA ابداع و معرفی گردیدهاستاما امکان بوجود آمدن انواع جدیدتری از آنها با قابلیتهای بیشتر در آینده بسیار محتمل می باشد. از جمله انواع مارکرهای DNA که بیشتریناستفادهرادر مطالعات مولکولی دارا می باشند. میتوان به RFLP، RAPD،AFLP ،DAF ، SSR،SNP و... اشاره نمود.
مارکرهای DNAدر یک تقسیم­بندی کلی به دو گروه مارکرهای مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلی­مراز و مارکرهای غیر­مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز تقسیم می­شوند.

1-5-1-2-2-1- مارکرهای DNA غیر­مبتنی برPCR مارکرهای غیر­مبتنی برPCR ، مارکرهایی هستند که بدون استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز تولید میگردند واساس کار آنها بر پایه برش قطعات DNAژنومی با استفاده از آنزیم­های برشی استوار می­باشد.
RFLP :Restriction Fragment Lenghth Polymorphism
چند­شکلی در طول قطعات حاصل از برش به وسیله­ی آنزیم­های محدودگر، مهمترین مارکر گروه مارکرهای غیر­مبتنی برPCR می باشد.
این تکنیک در اوایل دهه 1980 معرفی گردید، چند­شکلی به وجود آمده در اثر هیدرولیز DNA به وسیله یک اندونوکلئاز محدودگر، چند­شکلی پس از دو رگه شدن یک کاوشگر نشاندار شده با قطعات جدا شده روی ژل الکتروفورز و انتقال روی یک غشاء آشکار می­شود(تکنیک سادرن).
1-5-1-2-2-2- مارکرهای DNAمبتنی برPCR مارکرهای DNA مبتنی بر PCR مارکرهائی هستند که استفاده از آنها منوط به استفاده از محصولPCR می­باشد. با استفاده از تکنیک PCR در این مارکرها، دیگر نیازی به تهیه کاوشگر و انجام هیبریداسیون آن با قطعاتی DNA ژنومی برای آشکارسازی تفاوتها نبوده و پلی­مورفیسم به شیوه دیگری بررسی می گردد.
اساس کار در این گروه از نشانگرها بر پایه استفاده از یک توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان پرایمر برای تکثیر قطعه خاصی از DNAاستوار می باشد.
از جمله مهمترین مارکرهای این گروه میتوانISSR , SSR , DAF , AFLP , RAPD را نام برد.
RAPD:Random Amplified Polymorplic DNA
DNA چند­شکلی تکثیر شده تصادفی که اختصاراً رپید نامیده می­شود، یکیازمارکرهایاین گروه است. دراین روش قطعاتیاز ژنومنمونه­هایمختلف بطورتصادفی تکثیر شده و سپس قطعات تکثیر شده توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز از یکدیگر جدا میگردند. و برای تکثیر DNAبوسیلهPCR از یک پرایمر 8 تا10 نوکلئوتیدی با توالی دلخواهو تصادفی استفاده می­شود.

Amplified Fragment Length Poly morphism : AFLP
تفاوت طولقطعات حاصلازتکثیر که بصورت اختصاری AFLPنامیدهمی­شود، گروهدیگریاز مارکرهای مبتنی برPCR می­باشد. با این روش مارکرهایی تولید می­شوند که مزایای RAPD , RFLPرا تواماً دارا می­باشد. پایه و اساس این تکنیک که اولین بار در سال 1995 ارائه گردید، تکثیر انتخابی برخی قطعات از بین تمام قطعات برش یافته DNAژنومی می باشد.
DAF:DNA Amplification Fingerprinting
یکی دیگراز نشانگرهای مبتنی بر PCRکه از نظر اصول تکنیکی بسیارشبیهRAPDمی باشد،DAF یا انگشت نگاری با DNAتکثیر شده می باشد.
SSR: Simple Sequence Repeats
ردیف­های کوتاه تکرار شونده دسته­ای دیگر از مارکرهای مبتنی بر PCR می باشند که بنام میکروساتلایت­ها نیز خوانده می­شوند. استفاده از این تکنیک بر پایه این واقعیت است که یک سری توالی­های ساده و کوتاه دو تا پنج نوکلوتیدی به صورت تکراری در ژنوم بسیاری از موجودات یوکاریوتی وجود دارند. اساس کار مارکر SSRرا که یک مارکر چند­اللی و همبارز بوده و تنوع درون مکانی را نشان می­دهد، تشکیل می­دهند.
Inter Simple Sequence Repeats :ISSR
نشانگرهای ISSR از جمله نشانگرهای مبتنی بر PCRهستند که مزایای هر سه نشانگرSSR, AFLP,RAPD را دارا و فاقد معایبی از قبیل تکرار­پذیری کم و هزینه بالا می­باشد(سانتالا، 1988).
از این نشانگر به منظور تکثیر قطعه­ای از DNA بین دو ریز­ماهواره که در ژنوتیپ یک گونه در حالت عکس یکدیگر قرار گرفته­اند، استفاده می­شود.
این نشانگر تا حدودی مشابه نشانگر RAPD می­باشد با این تفاوت که در اینجا آغاز­گرها همان توالی ریز­ماهواره می­باشند که در یک انتها َ3 یا 5َ به 4-2 بازپورین یا پریمیدین متصل شده­اند.
در واقع همین مسئله مزیت این نشانگر نسبت بهSSRو RAPDرا موجب شده است چرا که مشکل پرایمرهای تصادفی در RAPD و انجام کلونینگ و توالی یا­بی ناحیه متصل به ریز­ماهواره­ها و طراحی پرایمر در SSR که بسیار دشوار و هزینه­بر است را برطرف نموده است. نحوه توارث آن همانند RAPD غالب است و در نتیجه هتروزیگوسیتی را نشان نمی­دهند.
همانگونه که می­دانیم ریز­ماهواره­ها اغلب غیر­عملکردی هستند و استفاده از نشانگرهای SSRفقط به شناسایی ارقام یا رده­بندی گونه­ای محدود می­شود اما نتایج آزمایشها نشان می­دهد نشانگر ISSRبه عنوان ابزاری مفید در نقشه­یا­بی ژنتیکی و انگشت نگاری DNA قابل استفاده است.
ISSRنشانگر مولکولی با کاربرد آسان است که بهDNA الگوی کمی نیاز دارد. این روش داده­هایی حاوی اطلاعات مفید، سریع قابل تکرار و ارزان ارائه می­نماید.

1-6- دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی
نشانگرهای مولکولی دارای کاربرد فراوان در اصلاح گیاهان دارویی هستند. فاکتورهایی همچون خاک و شرایط آب و هوایی، بقای یک گونه خاص و همچنین محتوای ترکیب دارویی گیاه را تحت تاثیر قرار می­دهند. در چنین حالاتی علاوه بر اینکه بین ژنوتیپ­های مختلف یک گونه تفاوت دیده می­شود از لحاظ ترکیب دارویی فعال نیز اختلاف وجود دارند.
در هنگام استفاده تجاری از گیاه دو فاکتور، کیفیت نهایی داروی استحصالی گیاه را تحت تاثیر قرار می دهند.
  1. تغییر محتوای یک ترکیب دارویی خاص در گیاه مورد نظر
  2. اشتباه گرفتن یک ترکیب دارویی خاص با اثر کمتر که از گیاهان دیگر بدست آمده است به جای ترکیب دارویی اصلی که از گیاه اصلی به دست می­آید.
چنین تفاوت­هایی، مشکلات زیادی را در تعیین و تشخیص گیاهان دارویی خاص با استفاده از روش های سنتی (مرفولوژیکی و میکروسکوپی) به دنبال خواهد داشت.
بنابراین با توجه به مشکلات موجود در زمینه شناسایی گیاهان دارویی با استفاده از روش­های سنتی و با توجه به پیشرفت محققین در زمینه ایجاد نشانگر DNA، استفاده از یک تکنیک نوین می­تواند ابزاری قدرتمند در استفاده کارا از گونه های موثر دارویی محسوب شود.
از جمله مزایای این نشانگرها، عدم وابستگی به سن و شرایط فیزیولوژیکی و محیطی گیاهان دارویی است که این فاکتورها نقش مهم و محدود کننده­ای در تولید و تکثیر گیاهان دارویی دارند. پروفیلی که از انگشت نگاری DNA یک گیاه دارویی بدست می­آید، کاملاً به همان گونه اختصاص دارد که در اصلاح و تکثیر یک گونه برتر بسیار حائز اهمیت است. همچنین برای استخراج DNA به عنوان ماده آزمایشی در آزمایشات نشانگر مولکولی، علاوه بر بافت تازه، می­توان از بافت خشک نیز استفاده نمود واز این رو، شکل فیزیکی نمونه برای ارزیابی آن گونه اهمیت ندارد.
نشانگرهای مختلفی بدین منظور ایجاد شده­اند که از آن جمله می­توان به روش­های مبتنی بر هیبریداسیون (مانند RFLP)، روش­های مبتنی بر PCR (مانند AFLP) و روش­های مبتنی بر توالی­یابی (مانندITS) اشاره کرد (قاسمی دهکردی، 1380).
1-7- اهداف مشخص تحقیق
در این پژوهش اهداف ذیل دنبال می­شود:
  1. بررسی و مطالعه وقوع تنوع سوماکلونال در نمونه­های حاصل از کشت بافت گیاه بارهنگ با استفاده از نشانگرهای ISSR
  2. بررسی تاثیر نوع ریز­نمونه، ترکیبات محیط کشت و تعداد واکشت بر میزان پلی­مورفیسم در نمونه­های گیاه بارهنگ


دریافت فایل
جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید





مقاله


پاورپوینت


فایل فلش


کارآموزی


گزارش تخصصی


اقدام پژوهی


درس پژوهی


جزوه


خلاصه


تحقیق درمورد نقش مطبوعات در توسعه سياسي

بررسی تاثیر هزینه های نمایندگی بر انعطاف پذیری

کتاب الکترونیکی مرگ در میزند

دانلود پایان نامه رشته حقوق (بررسي جرم پولشويي در

یافتن نقاط ضعف و قوت و تبیین کاستی های موجود در

دانلود گزارش کارآموزی رشته مکانیک – اصول ساخت

دانلود پاورپوینت طرح کسب و کار(Business Plan)

دانلود پاورپوینت طرح کسب و کار(Business Plan)

تحقیق درباره بزهكاري 222 ص

کار تحقیقی تاثیر سانه ای بر جرائم منافی عفت